PCR常見問題彙整-上集
PCR，全名聚合酶鏈鎖反應（Polymerase Chain Reaction），是一種常用的分子生物學技術，被廣泛應用於DNA的快速增幅與複製。這項技術的概念由美國生物化學家Kary Banks Mullis於1983年提出，並於1985年開始實際應用。它能在短時間內，通過循環加熱和冷卻步驟，逐指數倍增特定DNA片段，從而使微量DNA得以擴增至足夠數量進行分析和研究。然而，當您在做PCR時可能會遇到一些問題，今天我們要帶您來看看在實際操作PCR時，那些問題常會遇到及其解決方法有哪些!
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為什麼我總是P不出東西或目標片段很淡 (無任何條帶出現或條帶很淡)
- 試劑配錯：首先操作者須確保各種試劑加入的量是沒有問題的。
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ddH2O |
補水至您要的總體積μL |
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5X Taq DNA Polymerase Buffer |
4 μL |
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2.5 mM dNTP |
2 μL |
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Primer F (10 μM) |
0.5 μL |
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Primer R (10 μM) |
0.5 μL |
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Taq DNA Polymerase |
0.5 μL |
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Template DNA (< 1 μg) |
X μL |
大量操作或不熟悉者，很容易在試劑配置過程中忘記加到材料，PCR 原料缺一不可~讓BIO-DOC的2X Taq Master Mix解決您的煩惱 !
- 變性(denature)、黏合(annealing)及延長(extension)的溫度及時間，注意所選用的Taq適合的條件，需參照protocol來設定溫度及時間；另外還需注意Taq延長所需的時間，PCR片段長度越長，所需延長時間就需越久；現在已有很多是改良型的Taq可加快您的實驗速度
使用我們的2X Taq Master Mix Fast Condition擴增<1 kb片段延長時間只需10 seconds
- PCR條件設定錯誤
每種Primer有自己喜歡的PCR溫度及時間，若在儀器上設定錯誤，當Primer黏合不上時，就會無產物產出。
如果您的條件沒設定錯誤，Primer也不是在新試條件的階段，產物卻越來越淡或出不來了，可能需要回頭檢視您的PCR機是否因使用時間增加而有Peltiers和Sensor老化問題而造成機器溫度不準確而影響到實驗結果。
莉蒔科技提供您多點式溫度檢測服務及完整的PCR機溫度校正服務
- DNA膠體染色問題
若照膠時您的DNA Maker也沒呈現時，須檢視是否忘記做膠體染色，或染色劑失效
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優點：
- 使用方便，與樣品混合(稀釋至1X)即可Load膠 (同時具有6X dye與染膠的功能)
- 不需額外做膠體的內染或外染，並可降低膠圖的背景值
- 取代傳統具致癌性的EtBr
- 靈敏度高 – 只要0.14 ng的DNA就可以跑得出來
- 照膠時可選擇使用藍光或UV光
- 使用藍光照射，可提升後續實驗效率 (例如：Cloning )
- Annealing溫度不合適
新設計的Primer雖然會有建議Annealing溫度，但實際上機時仍須先做過測試，才能抓到最適合的PCR條件唷!
通常以2℃為梯度設計PCR反應來測試Annealing溫度。
- DNA模板量太少或太多
可參照下表作調整
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Templates |
Input Template DNA |
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Genomic DNA |
50 ~ 400 ng (通常建議1~200 ng) |
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Plasmid or Virus DNA |
10 pg ~ 30 ng |
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cDNA |
1 ~ 5 μL (≦1/10的PCR總體積) |
- 反應總體積的改變
理論上小體積變大體積時等倍放大即可，但放大體積後的第一次最好需做一次測試實驗，以免因體積變化而產生P不出來的問題
- Primer設計錯誤
若新Primer梯度溫度測試過
- Primer建議溫度的± 10 ~ 15℃
- 各種Primer濃度(
- 若綜合(1)及(2)的各種排列組合，還是無產物出現，則須至利用BLAST或程式軟體重新檢視Primer的特異性或重新設計適合的Primer
- DNA模板中存在抑製劑
- 確保DNA純化過程是否殘留有機溶劑及清潔劑，例如：EDTA, chloroform, phenol, ethanol, SDS, sarkosyl, tracking dyes等等的殘留
(通常使用傳統法萃取DNA易有殘留問題發生)
以Kit進行DNA萃取可解決此問題，且操作過程中不需使用到臭臭的有機溶劑唷!
- 萃取樣品中存在PCR抑制劑，通常在加工食品或乳酸菌中萃取DNA容易因加工品中的添加劑引起PCR抑制問題，可用專門萃取食品DNA的Kit及稀釋樣品後再做萃取來解決此問題
- PCR增強劑的過量添加，比如Betaine、DMSO及
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常見PCR反應抑制物 |
產量下降濃度 |
完全抑制濃度 |
備註 |
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SDS |
0.005% |
0.01% |
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苯酚 (Phenol) |
0.2% |
0.5% |
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乙醇 |
- |
>1% |
但在某些基因體上又能增加產量 |
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異丙醇 |
- |
- |
抑製作用比乙醇稍強 |
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乙酸鈉 |
- |
> 5 mM |
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氯化鈉 |
- |
>25 mM |
若是生理食鹽水則無影響 |
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EDTA |
0.5 mM |
1 mM |
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血紅素（heme） |
- |
>1 mg/mL |
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氯化血紅素（hemin） |
- |
>0.1 ng/μL |
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丹寧酸（tannic acids） |
- |
>0.1 ng/μL |
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肝素 |
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>0.15 IU/mL |
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尿素 |
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>20 mM |
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其他可能抑制PCR反應的物質：(內為物質可能來源) 腐殖質 (土壤、植物材料、自然界水)、植物多醣 (糞便、植物多醣)、聚苯乙烯、聚丙烯 (紫外線照射之塑膠材質)、膽酸鹽 (糞便)、膠原蛋白 (組織)、靛青染料 (粗斜紋棉布、牛仔褲)、蛋白酶 (牛奶)、鈣離子 (牛奶、骨頭)、鐵離子(血液)、二甲基苯胺、溴酚藍、膽紅素（bilirubin）以及其他抑製劑 |
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- PCR增強劑：
- DMSO (2 ~ 10%)或Glycerol：當模板DNA為GC rich時可添加
- 甲醯胺Formamide (1 ~5%)：作用與DMSO相似
- BSA (<0.8 μg/uL)：增加聚合酶的熱穩定度
- Betaine (0.5~2 M)：當模板DNA為GC rich或擴增長度較長片段時可添加，主在降低 denature與annealing 的溫度
- 其他PCR增強劑
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