PCR常見問題彙整-下集

• 非特異性片段的結合

1. 調高您的annealing黏合溫度，但須注意若調整太高PCR產物會出不來
2. 若調高annealing很多後仍然產生很多雜Band (通常不會超過68℃)，建議您重新設計您的Primer

如下圖若提高primer濃度，產物的亮度也會提升，並隨著黏合溫度上升會減少雜band。若試過各種條件調整還是無Major band出現或雜band太多會建議直接重新設計更具專一性的primer

3. 選用Hot Start型的Taq Polymerase; 熱啟動PCR (hot start PCR) 是指使Taq DNA 聚合酶只有在樣品溫度至少超過70℃時才發揮作用，此過程可減少因PCR升溫過程中Taq與部分單鏈模板形成的非特異性結合，並在後續被放大，來達到提高特異性的方法
4. 也可加入下列試劑讓polymerase和模板DNA間的非特異性結合減少： MgCl₂ (1.5 - 5.0 mM)、Tris-HCl (10 mM - 67 mM, pH 8.2 - 9.0)、KCl (25 mM - 50 mM)、Gelatin (0.01% - 0.1% (w/v))、非離子型洗滌劑、 Tween 20 ( 0.05% (v/v))、 Triton-X-100 (0.01% (v/v))、Tetramethyl ammonium bromide、 TMANO (trimethylamine N-oxide)、Betaine
5. 遞減PCR（touchdown PCR）可用來避免非特異性序列的擴增。

遞減PCR開始先設定一個比較高的黏合溫度，每個循環黏合溫度下降1℃，直到適合之黏合溫度後保持至PCR結束

在初始循環中，先以較高溫度讓特異性序列做擴增(讓特異性的模板變多)，再進行後續放大，此方法可減輕非特異性擴增對結果的干擾

• 為什麼我的DNA會出現smear現象

1. Taq過量或Taq品質差或運輸過程失活

可減少Taq用量或更換優質的Taq 

2. dNTP、MgCl₂、Primer濃度過高，可降低使用量
3. DNA模板濃度太高時會增加亂黏的機率，一般DNA模板建議濃度

Plasma DNA用量應< 50 ng

Genomic DNA則應< 200 ng

4. 循環次數過多,可增加DNA模板濃度並減少循環次數至30，縮短黏合及延長之時間,或用改用touchdown PCR
5. 黏合溫度過低,可增加黏合溫度
6. 跑電泳的問題：

1. Agar配置的緩衝溶液與跑電泳時的緩衝溶液濃度相差太大

(通常配置Agar的緩衝溶液即為跑電泳時的緩衝溶液)

緩衝溶液通常使用TAE或TBE Buffer

我們的Buffer提供您穩定的電泳環境還可節省您配置的時間唷! 

BDWB005 TAE 50X Buffer

BDWB006 TBE 5X Buffer

2. Agar凝固時動到它或質量差，導致膠體鑄造失敗

選擇優質Agar(BDA Agar、BDAG-500 Agarose、BDAGT-50 Agarose 錠狀)

• 陰性對照(試劑空白組)出現片段

PCR是種非常靈敏的試驗，當您的陰性對照出現反應時表示在操作過程中有汙染源的出現，可就下列幾點做排除。

1. 首先人員操作問題須先排除：

(1)污染區及非污染區使用不同的設備及器具

(2)在試劑準備、Sample處理及增幅後的分析時，使用不同的微量吸管分注器(Pipet)或用漂白水擦拭去汙

(3)使用內濾式的微量吸管尖(Filter pipette tips)可避免污染

(4)使用無粉手套，並經常更換手套(尤其不同區需區分)

(5)使用10-20%漂白水，再用酒精或二次水擦拭操作區域及pipet

(6)使用 swipe test檢查工作檯面或設備表面是否有污染的核酸

(7)不同工作區之間的氣流須控制正確的動線

(8)小心處理增幅後之產物(因增幅後產物可能成為汙染源之一)

(9)試管打開前需先spin down殘留在邊緣的液體，蓋子要輕輕打開，避免氣霧噴濺，並盡可能保持蓋子蓋上的狀態

(10)操作時先分裝配置好的mix後最後才加入模板DNA

(11)操作時人員的手不要從開蓋的物品上方經過

(12)陰性對照(試劑空白組)最後加入，以便偵測操作過程中任何可能的污染

2. 若懷疑試劑汙染，可先換新的試劑操作看看
3. 選用市售的RNA、DNA free的水來進行試驗

• 參考資料

https://m.biomart.cn/experiment/430/457/463/2284856.htm

https://zhuanlan.zhihu.com/p/608394655

https://www.iivd.net/article-23145-1.html

https://zh.wikibooks.org/zh-https://zh.wikibooks.org/zh-hant/%E7%94%9F%E7%89%A9%E5%8C%96%E5%AD%A6%E4%B8%8E%E5%88%86%E5%AD%90%E7%94%9F%E7%89%A9%E5%AD%A6/PCR%E5%AE%9E%E9%AA%8C%E6%8A%80%E6%9C%AF/PCR%E5%9F%BA%E6%9C%AC%E5%8E%9F%E7%90%86

https://www.thermofisher.com/tw/zt/home/life-science/cloning/cloning-learning-center/invitrogen-school-of-molecular-biology/pcr-education/pcr-reagents-enzymes/pcr-cycling-considerations.html