PCR常見問題彙整-上集

Una
2023-07-27

PCR，全名聚合酶鏈鎖反應（Polymerase Chain Reaction），是一種常用的分子生物學技術，被廣泛應用於DNA的快速增幅與複製。這項技術的概念由美國生物化學家Kary Banks Mullis於1983年提出，並於1985年開始實際應用。它能在短時間內，通過循環加熱和冷卻步驟，逐指數倍增特定DNA片段，從而使微量DNA得以擴增至足夠數量進行分析和研究。然而，當您在做PCR時可能會遇到一些問題，今天我們要帶您來看看在實際操作PCR時，那些問題常會遇到及其解決方法有哪些!

 

  • 為什麼我總是P不出東西或目標片段很淡 (無任何條帶出現或條帶很淡)

  1. 試劑配錯：首先操作者須確保各種試劑加入的量是沒有問題的。

ddH2O

補水至您要的總體積μL

5X Taq DNA Polymerase Buffer

4 μL

2.5 mM dNTP

2 μL

Primer F (10 μM)

0.5 μL

Primer R (10 μM)

0.5 μL

Taq DNA Polymerase

0.5 μL

Template DNA (< 1 μg)

X μL

 

大量操作或不熟悉者，很容易在試劑配置過程中忘記加到材料，PCR 原料缺一不可~讓BIO-DOC的2X Taq Master Mix解決您的煩惱 ! 

  1. 變性(denature)、黏合(annealing)及延長(extension)的溫度及時間，注意所選用的Taq適合的條件，需參照protocol來設定溫度及時間；另外還需注意Taq延長所需的時間，PCR片段長度越長，所需延長時間就需越久；現在已有很多是改良型的Taq可加快您的實驗速度

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  1. PCR條件設定錯誤

每種Primer有自己喜歡的PCR溫度及時間，若在儀器上設定錯誤，當Primer黏合不上時，就會無產物產出。

如果您的條件沒設定錯誤，Primer也不是在新試條件的階段，產物卻越來越淡或出不來了，可能需要回頭檢視您的PCR機是否因使用時間增加而有Peltiers和Sensor老化問題而造成機器溫度不準確而影響到實驗結果。

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  1. DNA膠體染色問題

若照膠時您的DNA Maker也沒呈現時，須檢視是否忘記做膠體染色，或染色劑失效

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優點：

  1. 使用方便，與樣品混合(稀釋至1X)即可Load膠 (同時具有6X dye與染膠的功能)
  2. 不需額外做膠體的內染或外染，並可降低膠圖的背景值
  3. 取代傳統具致癌性的EtBr
  4. 靈敏度高 – 只要0.14 ng的DNA就可以跑得出來
  5. 照膠時可選擇使用藍光或UV光
  6. 使用藍光照射，可提升後續實驗效率 (例如：Cloning )

 

  1. Annealing溫度不合適

新設計的Primer雖然會有建議Annealing溫度，但實際上機時仍須先做過測試，才能抓到最適合的PCR條件唷!

通常以2℃為梯度設計PCR反應來測試Annealing溫度。

  1. DNA模板量太少或太多

可參照下表作調整

Templates

Input Template DNA

Genomic DNA

50 ~ 400 ng (通常建議1~200 ng)

Plasmid or Virus DNA

10 pg ~ 30 ng

cDNA

1 ~ 5 μL (≦1/10的PCR總體積)

 

  1. 反應總體積的改變

理論上小體積變大體積時等倍放大即可，但放大體積後的第一次最好需做一次測試實驗，以免因體積變化而產生P不出來的問題

  1. Primer設計錯誤

若新Primer梯度溫度測試過

  1. Primer建議溫度的± 10 ~ 15℃
  2. 各種Primer濃度(一般反應時最終濃度約為0.2~0.4 μM)
  3. 若綜合(1)及(2)的各種排列組合，還是無產物出現，則須至利用BLAST或程式軟體重新檢視Primer的特異性或重新設計適合的Primer
  1. DNA模板中存在抑製劑
  1. 確保DNA純化過程是否殘留有機溶劑及清潔劑，例如：EDTA, chloroform, phenol, ethanol, SDS, sarkosyl, tracking dyes等等的殘留

(通常使用傳統法萃取DNA易有殘留問題發生)

以Kit進行DNA萃取可解決此問題，且操作過程中不需使用到臭臭的有機溶劑唷!

Genomic DNA 萃取 Plasmid DNA萃取 

  1. 萃取樣品中存在PCR抑制劑，通常在加工食品或乳酸菌中萃取DNA容易因加工品中的添加劑引起PCR抑制問題，可用專門萃取食品DNA的Kit及稀釋樣品後再做萃取來解決此問題
  2. PCR增強劑的過量添加，比如Betaine、DMSO及Glycerol等，在高濃度情況下，也會對PCR產生抑制性

 

常見PCR反應抑制物

產量下降濃度

完全抑制濃度

備註

SDS

0.005%

0.01%

 

苯酚 (Phenol)

0.2%

0.5%

 

乙醇

-

>1%

但在某些基因體上又能增加產量

異丙醇

-

-

抑製作用比乙醇稍強

乙酸鈉

-

> 5 mM

 

氯化鈉

-

>25 mM

若是生理食鹽水則無影響

EDTA

0.5 mM

1 mM

 

血紅素（heme）

-

>1 mg/mL

 

氯化血紅素（hemin）

-

>0.1 ng/μL

 

丹寧酸（tannic acids）

-

>0.1 ng/μL

 

肝素

-

>0.15 IU/mL

 

尿素

-

>20 mM

 

其他可能抑制PCR反應的物質：(內為物質可能來源)

腐殖質 (土壤、植物材料、自然界水)、植物多醣 (糞便、植物多醣)、聚苯乙烯、聚丙烯 (紫外線照射之塑膠材質)、膽酸鹽 (糞便)、膠原蛋白 (組織)、靛青染料 (粗斜紋棉布、牛仔褲)、蛋白酶 (牛奶)、鈣離子 (牛奶、骨頭)、鐵離子(血液)、二甲基苯胺、溴酚藍、膽紅素（bilirubin）以及其他抑製劑

 

  1. PCR增強劑：
  1. DMSO (2 ~ 10%)或Glycerol：當模板DNA為GC rich時可添加
  2. 甲醯胺Formamide (1 ~5%)：作用與DMSO相似
  3. BSA (<0.8 μg/uL)：增加聚合酶的熱穩定度
  4. Betaine (0.5~2 M)：當模板DNA為GC rich或擴增長度較長片段時可添加，主在降低 denature與annealing 的溫度
  5. 其他PCR增強劑

 

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