PCR常見問題彙整-下集
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非特異性片段的結合
- 調高您的annealing黏合溫度,但須注意若調整太高PCR產物會出不來
- 若調高annealing很多後仍然產生很多雜Band (通常不會超過68℃),建議您重新設計您的Primer
如下圖若提高primer濃度,產物的亮度也會提升,並隨著黏合溫度上升會減少雜band。若試過各種條件調整還是無Major band出現或雜band太多會建議直接重新設計更具專一性的primer
- 選用Hot Start型的Taq Polymerase; 熱啟動PCR (hot start PCR) 是指使Taq DNA 聚合酶只有在樣品溫度至少超過70℃時才發揮作用,此過程可減少因PCR升溫過程中Taq與部分單鏈模板形成的非特異性結合,並在後續被放大,來達到提高特異性的方法
- 也可加入下列試劑讓polymerase和模板DNA間的非特異性結合減少: MgCl2 (1.5 - 5.0 mM)、Tris-HCl (10 mM - 67 mM, pH 8.2 - 9.0)、KCl (25 mM - 50 mM)、Gelatin (0.01% - 0.1% (w/v))、非離子型洗滌劑、 Tween 20 ( 0.05% (v/v))、 Triton-X-100 (0.01% (v/v))、Tetramethyl ammonium bromide、 TMANO (trimethylamine N-oxide)、Betaine
- 遞減PCR(touchdown PCR)可用來避免非特異性序列的擴增。
遞減PCR開始先設定一個比較高的黏合溫度,每個循環黏合溫度下降1℃,直到適合之黏合溫度後保持至PCR結束
在初始循環中,先以較高溫度讓特異性序列做擴增(讓特異性的模板變多),再進行後續放大,此方法可減輕非特異性擴增對結果的干擾
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為什麼我的DNA會出現smear現象
- Taq過量或Taq品質差或運輸過程失活
可減少Taq用量或更換優質的Taq
- dNTP、MgCl2、Primer濃度過高,可降低使用量
- DNA模板濃度太高時會增加亂黏的機率,一般DNA模板建議濃度
Plasma DNA用量應< 50 ng
Genomic DNA則應< 200 ng
- 循環次數過多,可增加DNA模板濃度並減少循環次數至30,縮短黏合及延長之時間,或用改用touchdown PCR
- 黏合溫度過低,可增加黏合溫度
- 跑電泳的問題:
- Agar配置的緩衝溶液與跑電泳時的緩衝溶液濃度相差太大
(通常配置Agar的緩衝溶液即為跑電泳時的緩衝溶液)
緩衝溶液通常使用TAE或TBE Buffer
我們的Buffer提供您穩定的電泳環境還可節省您配置的時間唷!
- Agar凝固時動到它或質量差,導致膠體鑄造失敗
選擇優質Agar(BDA Agar、BDAG-500 Agarose、BDAGT-50 Agarose 錠狀)
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陰性對照(試劑空白組)出現片段
PCR是種非常靈敏的試驗,當您的陰性對照出現反應時表示在操作過程中有汙染源的出現,可就下列幾點做排除。
- 首先人員操作問題須先排除:
(1)污染區及非污染區使用不同的設備及器具
(2)在試劑準備、Sample處理及增幅後的分析時,使用不同的微量吸管分注器(Pipet)或用漂白水擦拭去汙
(3)使用內濾式的微量吸管尖(Filter pipette tips)可避免污染
(4)使用無粉手套,並經常更換手套(尤其不同區需區分)
(5)使用10-20%漂白水,再用酒精或二次水擦拭操作區域及pipet
(6)使用 swipe test檢查工作檯面或設備表面是否有污染的核酸
(7)不同工作區之間的氣流須控制正確的動線
(8)小心處理增幅後之產物(因增幅後產物可能成為汙染源之一)
(9)試管打開前需先spin down殘留在邊緣的液體,蓋子要輕輕打開,避免氣霧噴濺,並盡可能保持蓋子蓋上的狀態
(10)操作時先分裝配置好的mix後最後才加入模板DNA
(11)操作時人員的手不要從開蓋的物品上方經過
(12)陰性對照(試劑空白組)最後加入,以便偵測操作過程中任何可能的污染
- 若懷疑試劑汙染,可先換新的試劑操作看看
- 選用市售的RNA、DNA free的水來進行試驗
- 參考資料
https://m.biomart.cn/experiment/430/457/463/2284856.htm
https://zhuanlan.zhihu.com/p/608394655
文章專欄